1997年2月，英国《自然》杂志宣布世界上第一头克隆动物——绵羊“多利”诞生。之后，各国科学家相继克隆出牛、鼠、猪、狗、兔等多种动物，但是对属于灵长类的猴子，却一直无能为力。

今年1月25日，《细胞》杂志在线发表中国科学家的论文，宣布“中中”和“华华”两只克隆猴诞生，这是科学家首次用体细胞成功克隆出非人灵长类动物。

“多利”羊诞生后的20年里，世界上不少实验室都在尝试用类似的技术路线克隆猴子，但一直没有成功。中国科学家培育成功的体细胞克隆猴“中中”和“华华”，虽然沿用的是与“多利”羊类似的技术，但却通过几处关键“更新”，突破了困扰科学界多年的技术瓶颈。

“多利”和“中华”的技术路线

从A猴提取体细胞，经培养并取出细胞核→植入B猴的去核的卵母细胞，形成融合细胞→用化学物质促使融合细胞发育成囊胚和胚胎→胚胎植入C猴(代孕猴)的子宫，孕育并产下克隆猴。这是中国科学院神经科学研究所孙强团队经过5年努力，培育“中华”姐妹猴的技术路线。

21年前，英国爱丁堡罗斯林研究所伊恩·维尔穆特团队也是通过差不多的方式，创造了大名鼎鼎的克隆羊“多利”。不同的是，“中中”和“华华”是用化学物质刺激融合细胞成为胚胎，然后孕育出来的新个体；而“多利”是利用电脉冲方法刺激融合细胞分裂发育成为胚胎的。

克隆指的是生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体或种群。无性繁殖研究的历史很早，但首个震惊世人的结果是“多利”羊的诞生——

从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞(供体细胞，也是体细胞)，将其放入低浓度的营养培养液中，让细胞逐渐停止分裂；对一头苏格兰黑脸母绵羊注射促性腺素，促使其排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞(受体细胞)；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，形成了融合细胞，后者像受精卵一样能进行细胞分裂、分化，从而形成囊胚和胚胎；将融合细胞生成的胚胎转移到另一只苏格兰黑脸母绵羊(代孕母体)的子宫内，发育成胚胎，最后诞生出小绵羊“多利”，它与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。

从总体技术路线上看，“中华”猴几乎延续了“多利”羊的诞生轨迹，但实则跨越了几道技术门槛。据论文通讯作者、中国科学院神经科学研究所研究员孙强介绍，在克隆猴的过程中有四个关键性节点：胚胎构建、卵细胞激活、核基因启动、着床后发育。如何攻克这四个节点对于研究人员来说，是极大的挑战。

克隆猴打通了哪些技术瓶颈

中国研究人员曾使用成年猕猴细胞作为细胞核供体，但产生的克隆猴都在出生几小时后死亡，因此“中中”和“华华”采用的是猴胚胎的成纤维细胞作为供体细胞。这种胚胎细胞尽管也是体细胞，但是尚未定性，有很大的发育空间，因此孕育起来更为容易；而“多利”采用的供体细胞已经是定性的成年体细胞，在重新发育上相对更为困难。

对于其他动物来说，去除卵母细胞的细胞核也许算不上什么大难题。例如，小鼠的卵母细胞在普通光学显微镜下是半透明的，能比较清楚地显现细胞中的细胞核，研究人员容易进行去除细胞核的操作，因而也容易把供体细胞的细胞核移入。

可猕猴的卵母细胞的透明度很低，很难找到其中的细胞核，需要使用间断的特殊光照，才能在闪烁的光线下捕捉到若隐若现的细胞核身影，然后去除细胞核。论文第一作者、中科院神经所博士刘真花了大量时间来进行核移植的操作训练，最后实现了在10秒内精准完成对卵母细胞的去核显微操作，而且能在15秒之内将供体细胞注入到去核的卵母细胞中去。

中科院神经所所长、论文共同作者蒲慕明表示：“体细胞核移植技术流程非常关键，操作越快，卵细胞受损就会越小，流程的优化极大地帮助了我们。”

此外，如何让融合的供体细胞核与受体卵母细胞结合的新细胞形成胚胎并发育，也是一件很困难的工作。

研究人员经过多次试验，采用一种化学物质来激活核移植后的卵母细胞，让新融合的细胞形成囊胚(胚胎)，但是通过这种方法产生囊胚的比例只有13%。要让囊胚发育为新的个体还需要产生具有内细胞团的优质囊胚。后来，又经过多种尝试，研究人员成功使融合细胞生成的囊胚率达到45%，优质囊胚率则达到29%。

此次，上海科学家利用猴胚胎成纤维细胞创造了109个克隆胚胎，将其中近四分之三植入了21只代孕猴体内，怀孕6例，最终诞生了“中华”姐妹。而当年，维尔穆特团队总共进行了277次核移植，产生了29个胚胎，由13只母羊代孕，最终只有“多利”幸运地诞生。

截至目前，已有23种哺乳动物通过体细胞核移植的方法被成功克隆，它们有的作为动物模型用于科研，有的则作为人类潜在的器官供体来源(比如克隆猪)。越接近于人类，动物模型的应用价值越大，与此同时，克隆的难度也越大。

文 | 张田勘

原文刊于2018年2月4日文汇报，原题为《揭秘克隆猴：从“多利”羊到“中华”猴，这一步为何跨越20年？》

编辑 | 朱一君