...岛襟副翼残骸今鉴定将被 DNA式 分析
付翔新
[摘 要]本文通过线粒体DNA序列比对分析建立种属鉴定方法，对人、马、牛、羊等物种的线粒体DNA中的cytb（细胞色素b基因）和ND6基因进行序列对比，引物设计得出结果。研究结果显示，cytb基因在不同生物物种中相似度较高，选取序列设计通用引物，在ND6基因中选取差异较大位点设计出人特异性的ND6基因引物。经筛选共得到一对通用引物和一对特异性引物，可通过实验进一步验证，为利用线粒体进行种属鉴定提供参考。
[关键词]线粒体DNA；cytb（细胞色素b基因）；ND6基因；种属鉴定
中图分类号：D919.4 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）35-0098-01
1 综述
1.1 研究背景
随着科技的进步，犯罪分子的手段也在不断更新换代，犯罪人员的反侦查意识不断提高，传统的现场物证（如指纹、掌纹、足迹等）遗留在犯罪现场的概率在不断缩小，从而导致勘查犯罪现场的难度也在不断上升。生物物证所拥有的传统物证不具备的优点越来越受到重视，生物物证以其独特的易遗留性和隐蔽性容易被犯罪分子所忽视，又以其抗破坏性能够较为完整的保留和提取，为技侦人员的现场勘查工作提供了一条重要的线索，为侦查人员打开疑难案件的缺口提供了有力支持。
1.2 cytb与ND6基因片段
1.2.1 cytb基因
cytb蛋白是细胞色素b氧化酶，由线粒体DNA H链编码。这一基因的编码序列区进化比较慢，相对较为保守。存在于所有哺乳动物中，针对这一基因的保守区设计引物，可以扩增出人和动物的生物样本。
1.2.2 ND6基因
作为线粒体DNA编码基因中的一个，ND6基因由线粒体DNA H链编码。将动物的ND6基因序列与人的标准ND6基因序列进行对比，可以发现人与其他生物样本碱基序列相差最大的区域在该基因的288-375bp区域。
2 实验
2.1 实验方法
2.1.1 序列下载
在国家生物技术信息中心，网站中的基因库中下载了六种牛生物线粒体DNA中的cytb与ND6序列。
2.1.2 序列比对
（1）使用clustalx软件来完成比对工作。
（2）使用引物设计软件“Primer Premier 5”完成引物设计
2.2 实验结果
2.2.1 序列完全比对
（1）经过上述实验操作后，在六种生物物种的cytb基因完全对比结果中，得出六条cytb基因的完全比对结果。
（2）根据完全对比的结果分析，找到一段人的cytb基因片段，这一片段在六种生物物种中有很高的相似度，截取的区域是217bp-324bp，长度为108bp。因为这一片段在六种生物的cytb基因中相似度最高，在该区域设计六种生物物种的通用引物，在PCR扩增中作为阳性对照，六种生物物种PCR扩增后均有该条带。
（3） 重复上述操作，在六种生物物种的ND6基因完全对比结果中，得出六条ND6基因的完全比对结果。
（4）根据完全对比的结果分析，找到两段人的ND6基因片段，这两个片段在不同物种中相似度较低，根据结果对这两段基因片段进行截取，分别作为上游引物和下游引物设计目标区域。
2.2.2 引物设计
（1）软件设计引物
本实验使用了“clustalx”软件分析了六种生物物种的cytb基因与ND6基因序列，找到了在六种生物物种cytb基因中相似度较高的基因片段一段和在ND6基因中对人特异性较高的基因片段两段，然后利用“Primer Premier 5”软件分别对这三段基因序列进行PCR扩增的引物设计，最后得到cytb paris（成对引物）5对；ND6上游引物6条，下游引物4条。
（2）引物筛选
在经过软件设计出来的大量引物中，分別找到两对引物，让其中的cytb基因引物可以顺利地扩增出实验中六种生物物种基因，ND6基因引物只能够特异性的扩增出人的基因而无法对其他五种生物物种基因进行扩增。选取引物的方法如下；首先对上述所有引物进行转化，并且依照5-3的方向进行排序，然后使用“clustalx”软件来进行完全比对，对上表引物和下载的六种生物物种的cytb与ND6基因逐一比较，比较的标准以五个碱基为基准，对cytb基因的对比中，最大差异段不能超过五个碱基长度；对ND6的对比中，最大相同片段不能超过五个碱基长度。再然后根据引物的解链温度来筛选，成对引物的解链温度相差最好不要超过1℃，相结合“Primer Premier 5”给出的引物分值，确定可以很好地扩增出实验中六种生物物种基因的cytb基因引物与只能够特异性的扩增出人的基因的ND6引物，运用这两对引物分别对未知生物序列扩增，根据结果判断种属关系从而进行种属鉴定。
在筛选引物过程中，还需要遵循以下原则：①引物与模板的序列要紧密互补，②引物和引物之间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构，③引物不能在模板的非目的位置引发DNA错配[18]。根据这一原则，经筛选后，最后得到的两对引物（表1）。
3 结论
本文主要研究通过mtDNA中的cytb和ND6基因进行种属鉴定，区分人源和非人源检材。在分别对人、羊、牛、马、猪、犬六种物种的cytb基因与ND6基因的对比分析后，确定在cytb基因中不同生物物种相似度较高的片段以及在ND6基因中人与其他物种差异较大的两个片段，分别对其进行引物设计，以用于种属鉴定。
（1）通过六种生物的cytb与ND6基因序列对比，找到根据完全对比的结果分析，找到一段人的cytb基因片段，区域是217bp-324bp，长度为108bp，这一片段在六种生物物种中有很高的相似度：对于ND6基因，找到两段人的特异性基因片段，区域是1bp-112bp，长度为112bp、228bp-340bp，长度为113bp，这两段基因片段与其他物种生物物种同区域片段相差较大。
（2）根据上述目标区域分别设计引物，得到两对成对引物，cytb基因通用引物正向引物长度22bp，反向引物长度24bp，可以扩增出六种物种相似度较高的区域88bp，ND6基因特异性引物上游引物长21bp，下游引物长20bp，能扩增出人的特异性片段287bp，将人与其他五种生物物种区分过来，来进行种属的识别与鉴定。
通过本次实验，在今后的实际工作中，提取现场生物检材的线粒体DNA，可以参照此方法利用这两段基因片段分别设计引物，来区分检材是否为人源。也可以进一步按照此方法对线粒体DNA中其他的基因片段进行设计引物，来区分为非人源外的具体物种，从而达到种属鉴定的目的。
参考文献
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