正交试验法优化氧颗粒污泥培养条件的研究.pdf
柴燕梅
[摘 要]在本文中，通過对黑曲霉的培养条件进行深入的探究，通过实验对比法，来确定黑曲霉培养的主要条件，并对培养条件中的温度、p H、装液量、接种量、氮源等条件的优化，以此来提高黑曲霉产果胶酶活力。
[关键词]黑曲霉； 果胶酶； 木聚糖酶； 纤维素酶； 酶活
中图分类号：Q93-3 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）25-0386-01
黑曲霉通过化验室菌种纯培养技术，在代谢过程中可以产生多种生物酶，是美国食品药品管理局准许使用的食品工业酶的主要生产菌。在现代微生物发酵工程化工技术生产中，其所产的酶种类最为丰富，现已经成为化工工业生产中常见的菌种之一。
1.材料与仪器
1.1 材料
黑曲霉M1、M2、M3、KC1、KC2、KC3，木聚糖，果胶，羧甲基纤维素钠（CMC），D-（+）半乳糖醛酸、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸钠、酒石酸钠、氢氧化钠、苯酚、柠檬酸、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、无水亚硫酸钠、PDA马铃薯琼脂培养基、麸皮。
1.2 仪器（表1）
2.实验过程
2.1 黑曲霉的培养及产酶酶活的测定
化验室无菌条件下使用接种针将黑曲霉菌种转接于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）无菌平板中，在每个平板底部做好标记，置于30℃培养箱中培养40h至单菌落生长形成，种子活化成功。
2.2 黑曲霉培养条件的优化
采用2.1的方法将黑曲霉活化培养，选出2.1中产酶最高的黑曲霉菌株，采用单因素实验优化发酵条件，从温度、pH、接种量、装液量、碳源、氮源6个主要因素入手，讨论不同实验条件下M1产酶活力的变化。
3.结果与讨论
3.1 黑曲霉菌种产果胶酶活力比较
通过比较图1，2可知，菌种M1、M2、M3普遍比菌种KC1、KC2、KC3所产酶活力高。并且果胶酶活力到达10倍。M1产果胶酶活力最高，并且M1产果胶酶时间较M2，M3提前，说明M1活化时间较短，繁殖迅速，并且产酶周期短，更适用于工业生产。
3.2 黑曲霉菌种产木聚糖酶活力比较
不同培养时间对黑曲霉产木聚糖酶活力有不同的影响。M1产木聚糖酶较高，木聚糖酶最高酶活1072.9IU/mL，约比M2高20.3%，比M3高42.6%。KC1、KC2、KC3产木聚糖酶能力较弱。M1、M2、M3产木聚糖酶活力约比KC1、KC2、KC3高15倍。
3.3 黑曲霉菌种产纤维素酶活力比较
不同培养时间对黑曲霉产纤维素酶活力有不同的影响。M1、M2、M3和KC1、KC2、KC3产纤维素酶能力均比较弱。M1产纤维素酶最大酶活力368.8IU/mL，仅为果胶酶最大酶活力的三分之一。M1产纤维素酶活力较M2、M3稍高，KC1、KC2、KC3产纤维素酶能力较弱。
3.4 pH对M1产酶活力的影响
在pH=4.0时M1产果胶酶活力最大，为1229.4IU/mL，随着pH值的增大，果胶酶活力下降，而木聚糖酶活力随着pH值的升高逐渐增大，在pH=7.0时木聚糖酶活力最大，为1269.6IU/mL。原因主要是由于果胶酶为酸性酶，在酸性条件下利于果胶酶的产生，而木聚糖酶一般为中碱性酶，M1主要分泌中性木聚糖酶，因此在pH=7.0时木聚糖酶活力达到最大。M1产纤维素酶的活力较弱，考虑到我们优化的方案中，果胶酶所占比例较大，因此我们确定M1的最佳产酶pH值为4.0。
3.5 装液量对M1产酶活力的影响
M1的产酶活力随着装液量的不同而变化。装液量加大，培养基中的营养物质增多，有利于M1的生长繁殖，为M1产酶提供营养物质。随着装液量的增大，将会导致培养基中溶解氧的含量减少，溶解氧含量减少，将会一定程序上抑制M1进行生物代谢，同时产生有毒物质，导致M1死亡，不利于产酶。因此，选择在250mL锥形瓶中装有50mL培养基，更有利于M1产混合酶。
3.6 不同氮源对M1产酶活力的影响
固定氮源的含量为15g/L时，以硝酸盐NaNO3和KNO3、铵盐（NH4）2SO4和NH4Cl作为无机氮源，以蛋白胨和牛肉膏作为有机氮源来探讨氮源对M1产酶活力的影响。无机氮源产酶活力普遍比有机氮源高。在培养基中，当有机氮与无机氮同时存在时，黑曲霉首先利用无机氮，而硝酸盐需还原成氨盐后才能通过调节机制进入有机体中，所以（NH4）2SO4和NH4Cl产酶活力高于NaNO3和KNO3。铵盐既或以调节代谢，也可以控制pH，因此选用（NH4）2SO4作为培养黑曲霉M1生长的氮源。
4.小结
（1）菌种M1、M2、M3产果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶活力普遍比KC1、KC2、KC3高。M1产果胶酶活力最高，为1100.5IU/mL；M2所产果胶酶活力较M1稍弱，为1072.9IU/mL；M3产果胶酶最大酶活为1050.5IU/mL。其次，M1产木聚糖活力较高为1072.9IU/mL，而M2和M3产木聚糖酶活力仅为891.7IU/mL和587.7IU/mL。再次，M1产纤维素酶活力368.8IU/mL高于M2的333.2IU/mL和M3的306.8IU/mL。通过对黑曲霉菌种的筛选得到最佳菌种M1，将M1作为优化培养基的出发菌种。
（2）通过对M1产果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶活力的比较，确定了最佳培养温度30℃，pH4.0，接种量5%，250mL锥形瓶装液量为50mL时，酶活力达到最大。通过对培养基碳源、氮源和复合碳源的优化，确定了最佳碳源为麸皮，最佳氮源为（NH4）2SO4。
