薄层色谱柱色谱及凝胶色谱法.ppt

张丽娜

[摘 要]比较了多种阿奇霉素的薄层色谱条件，确定了分离效果较好的展开系统和灵敏度较高的显色剂。设计了系统适用性实验方法和三个浓度的对照品，从而确定了较理想的阿奇霉素及有关物质薄层色谱检测法。市售硅胶预制版，展开剂为乙酸乙酯一正乙烷一二乙胺，显色剂为苯酚3g，硫酸5m1、无水乙醇95 m1混匀，均匀喷至板上后80 C加热数分钟。该法灵敏度高、分离效果好，特别是系统适用性实验和多浓度点对照液的设计，弥补了薄层色谱法测定阿奇霉素及其有关物质时结果的准确性易受薄层色谱条件影响、且量化功能较差的弱点，具有一定的特色。

[关键词]阿奇霉素；薄层色谱法；降解物质；溶剂系统；显色剂

中图分类号：R443 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）10-0339-01

阿奇霉素在当前我国临床医学中得到较为广泛的应用，属于新一代的大环内酯类抗生素，在广谱抗菌方面具有重要作用。国际上对阿奇霉素及其有关物质的测定主要有TLC法和HPLC法。在我国对阿奇霉素及其有关物质进行测定时，应当结合我国的实际情况进行系统化分析，就我国当前检测仪器和试剂的纯度条件进行分析，我们主要采用薄层色谱法对阿奇霉素及其有关物质进行检测，选取分离效果较好的展开系统以及灵敏度较高的显色剂，对阿奇霉素及其有关物质的检测结果进行可靠地保证。

1 检测材料的选取

阿奇霉素标准品，批号：960202，北京药品检验所标定，效价为975u/mg，有关物质低于1. 5%；红霉素标准品，批号： 3079312，中国药品生物制品检定所，效价为888u/mg；阿奇霉素原料及胶囊，北京太洋药业公司提供。

苯酚、磷铂酸、无水乙醇、硫酸、乙酸乙酯、正乙烷、二乙胺、三乙胺、三氯甲烷、甲醇、苯、冰乙酸均为市售分析纯。

硅胶G预制板，市售，青岛海洋化工厂和北京科聚友医药生物工程研究所生产。

2 检测方法与检测结果分析

2.1 对五种TLC展开剂进行对比分析

称取阿奇霉素标准品、红霉素标准品适量，并选取经过标准高温条件下进行加热的阿奇霉素样品适量，三种样品分别加入污水乙醇进行溶解，并加入标准溶液进行稀释，确保稀释后的溶液每1毫升中大约含有30毫克的溶液，在此基础上取适量阿奇霉素和红霉素标准品溶液进行混合。那么通过观察分析可知，当前共有四种溶液，我们分别对这四种溶液进行选取，滴于同一规格的硅胶预制板上，通过五种TLC展开剂进行展开并进行晾干，在此基础上喷以相同的显色剂进行显色，斑点形状及斑点个数见表1.

通过苯-三氯甲烷-三乙胺（4：5：1）展开剂进行展开时，能够将阿奇霉素与红霉素进行合理的分离，但拖尾现象较为明显，在一定程度上影响了加热破坏后样品的杂质检出，导致杂质检出的实际效果缺乏准确性。通过乙酸乙酯-正乙烷-二乙胺（5：5：1）展开剂对溶液进行展开时，可以看出阿奇霉素和红霉素得到了有效的分离，无明显拖尾现象，具有良好的杂质检出效果。通过三氯甲烷-笨-甲醇-浓氨（10：30：10：0.5）进行展开，可以观察到阿奇霉素和红霉素勉强得到分离，尽管不存在拖尾现象，但是杂质检出的效果并不理想，仅能够检测出阿奇霉素、红霉素以及三个其他杂质斑点。使用笨-三氯甲烷-三乙胺（5：4：1）展开剂能够使阿奇霉素和红霉素得到有效的分析，拖尾现象相对比较严重，并且在很大程度上影响了杂质的检出效果，无法可靠地检测出其他杂质斑点。使用甲醇-冰乙酸-水（8：2：1）进行展开时，阿奇霉素和红霉素勉强得到分离，但加热破坏后样品杂质不能够得到有效的检出。从整体情况来看，乙酸乙酯-正乙烷-二乙胺（5：5：1）展开剂的实际应用占优势，具有良好的检测效果。

2.2 三种显色剂的对比分析

将上述阿奇霉素标准品溶液适量用无水乙醇稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，分别吸取适量点于同一硅胶G薄层板上（同时点3块板），用上述B展开剂展开，取出晾十后分别喷以A，B，C 3种显色剂显色，由表2可看出，显色剂B在检测灵敏度、斑点与背景颜色反差力一面均较A，C显色剂优越。综上所述，硅胶G为固定相，乙酸乙酯一正乙烷一二乙胺（5：5：1）为展开剂，显色剂为苯酚3g、硫酸5m1、无水乙醇95m1混匀，喷匀后在80度加热数分钟，此薄层色谱系统可作为阿奇霉素及其有关物质较理想的检测方法。

2.3 阿奇霉素及其有关物质的检查

取本品适量，精密称定，用无水乙醇溶解并制成每1ml中含30mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取该溶液2.0ml，并取红霉素标准品30mg，置同一100m1容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（1）；另精密量取供试品溶液1. 0和0. 5m1，分别置100m1量瓶中，加同溶稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（C2）和（C3）。按薄层色谱法实验，吸取上述4种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯一正乙烷一二乙胺（5：5：1）为展开剂，展开后，晾干，喷以显色液（取苯酚3g、硫酸5m1、无水乙醇95m1混匀），置80 C加热数分钟，至班点显现。对照溶液（1）中阿奇霉素与红霉素斑点应分离完全；供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，最大杂质斑点的颜色不得深于对照溶液（1）的主斑点（2%）；杂质总量不得超过3%。

2.4 供试品溶液的稳定性考察

取上述阿奇霉素标准品溶液于配制2，4，24h后分别点样，结果供试品溶液在4h内可基本稳定，在24h后阿奇霉素有大部分变为红霉素。

3 讨论

3.1TLC法测定阿奇霉素及其有关物质的实际分离效果若存在一定差异性，那么会对测定的精准程度产生一定影响，这就需要通过系统适用性试验来对系统的有效性进行准确的检测，从而明确阿奇霉素及其有关物质实际含量。通过测定试验可知，红霉素是阿奇霉素的主要降解物质，易于得到，且斑点物质与阿奇霉素相邻，因而选取红霉素作为薄层色谱的适用性实验的标准物质，对于保证色谱系统有效性方面具有重要意义。

3.2TCL法在实际应用过程中对阿奇霉素及其有关物质进行测定时，也不免存在一些弱点，尤其是在遇到多个杂质斑点出现时，对于斑点杂质总量的加和上存在一定难度。这就要求在进行阿奇霉素及其有关物质进行测定时，可以通过多种浓度对照液的科学化配制，通过合理的比较估算，一定程度上保证分析结果的准确性和可靠性。

3.3薄层色谱法在对阿奇霉素及其有关物质进行测定的过程中，采用来自两个生产厂家的硅胶预制板进行测定实验，实验效果呈现一致性。

3.4通过相关实验研究可知，薄层色谱法检测阿奇霉素及其有关物质的具体实验方式在阿奇霉素片以及胶囊的测定试验中也同样适用，也适用于罗红霉素、克拉霉素及有关物质的检测。

3.5在薄层色谱法测定实验中，为有效的保证测定的准确性，应当充分衡量降解物质的可能性影响因素，保证在两个小时内将供试品溶液使用完毕。

参考文献

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[2] 蒋哗，刘红菊，薛娜，郝晓花.阿奇霍素片的茜素红荷移分光光度法测定[期刊沦文]中国医药工业杂质2005（08）.