王锐+吕中华+张道旭+梁秋波+李郑武

摘要：本研究以人白介素1受体（IL-1R）蛋白免疫巴比西小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术，获得3株可稳定分泌抗人白介素1受体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5A5、5C3和1C4。ELISA鉴定结果表明，3株单抗的亚型均为IgG1，轻链为K链，腹水效价都在5×10-5以上。经鉴定证实，3株单抗均可与真核表达的人白介素1受体发生特异性反应。结果表明，本研究成功获得3株针对人白介素1受体的特异性杂交瘤细胞株。

关键词：人白介素1受体；单抗

【分类号】R735.2

IL-1受体有I型（IL-1R I）和Ⅱ 型（IL-1R II），人IL-1RⅠ 基因编码549个氨基酸，其中胞外区316个氨基酸，单次跨膜区20个氨基酸和胞内区213个氨基酸，分子量为80 kDa，含有3 个免疫球蛋白样结构域。VIGERS等[1] 对IL-1与IL-1RⅠ 复合物的晶体结构研究发现，IL-1RⅠ 的第1个和第2个免疫球蛋白样结构域的内部通过二硫键形成一定空间构象的刚性结构，具有不可变性，而与之相连的第3个免疫球蛋白样结构域则在一定范围内具有一定的可变性。

1 材料

人白介素-1受体：本室提供；胎牛血清，1640培养基，HT， HAT，聚乙二醇：Sigma公司；鼠源单抗亚类试剂盒：SouthernBiotech；其余生化试剂均为分析纯。

2 方法

2.1动物免疫

按照萨姆布鲁克J等[2]报道的方法，将人白介素-1受体作为免疫蛋白[3]。以1μg/μL的浓度，对6只7周龄巴比西小鼠进行免疫，每只接种100μL，间隔2周免疫一次，共3次，细胞融合于最后一次免疫后7天进行。

2.2 ELISA方法的建立

以人白介素-1受体蛋白为抗原包被酶标板，用碳酸盐缓冲液稀释抗原，方阵法确定蛋白最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释倍数，经HRP标记的山羊抗鼠IgG作用，邻苯二胺底物显色，判定结果。判定标准为阳性血清孔的OD492值接近1.0，阴性血清OD492值<0.2，P/N≥2.1。

2.3细胞融合及筛选

抗血清效价检测于第3次免疫后7天进行。取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，按常规方法进行融合，HAT筛选融合细胞，采用有限稀释法对阳性克隆进行筛选，达到100%阳性者扩大培养，建株保存。

2.4单抗亚类鉴定

按SouthernBiotech公司亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。

2.5腹水制备

采用体内诱生腹水法，按常规方法制备腹水。用建立的ELISA检测方法测定单抗腹水效价，以P/N≥2.0的抗体最大稀释度作为效价终值。

2.6抗体识别特异性鉴定

用三株杂交瘤细胞腹水纯化后蛋白做酶联免疫吸附实验，包被蛋白为IL-1、IL-1R和IL-18bp，经鉴定3株单抗均能与人白介素-1受体反应，说明筛选得到的单抗可以特异性识别人白介素-1受体，进一步证实了所获得单抗的特异性。

2.7 IL-1R单克隆抗体亲和力鉴定

采用非竞争酶免疫法测定已获得的3株杂交瘤细胞分泌抗体的亲和力。

1）包被：用包被液稀释纯化的IL-1R蛋白至1.5μg/ml，0.75μg/ml，0.375μg/ml，0.1875μg/ml，，加入96孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜包被；

2）封闭：用PBST洗涤3次，拍干后，每孔加入200 μL封闭液，37 ℃封闭1 h；

3）一抗：PBST洗涤3次，拍干后，将各株IL-1R单抗浓度调整为1μg/ml，进行倍比稀释（8个梯度），每孔加入100 μL， 37 ℃孵育1 h；

4）二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗稀释至1：10000，每孔加入100 μL，37℃孵育1 h；

5）显色：PBST 洗涤3次，拍干，加入底物液（OPD），室温避光作用13 min；

6）终止：每孔加入50 μL终止液，轻轻振摇混匀；

7）测定OD492 / OD630值。

3 结果

3.1间接ELISA方法结果

将白介素-1受体蛋白，以4g/ml 、2g/ml 、1g/ml和0.5g/ml的浓度包被ELISA板，阳性和阴性血清稀释倍数为1：100、1：500、1：1000，结果显示，抗原浓度在1μg/ml，血清稀释倍数为1/1000时，P/N≥2.1。

3.2 细胞株的建立

细胞融合后，判定为阳性的杂交瘤细胞经3次克隆筛选，获得3株能够稳定分泌白介素-1受体单抗细胞株，分别命名为5A5、5C3和1C4。

3.3 单抗亚类鉴定

经单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测，所获3株杂交瘤细胞，均为IgG1型，轻链为K型。

3.4单抗腹水效价及纯度测定

经鉴定表明3株单抗5A5、5C3和1C4腹水采用ELSIA法测定效价都在5×10-5以上。电泳纯度95%以上，结果如下：

3.5 单抗特异性鉴定

采用酶联免疫吸附实验，结果显示3株单抗均能特异性的识别人白介素-1受体。

3.6 IL-1R单克隆抗体亲和力鉴定结果

亲和力常数（KA）计算：根据抗原抗体结合的S形曲线，求解不同抗原浓度下半数吸

光值的抗体浓度，代入公式KA=（n-1）/2（ nAb′- Ab）计算亲和常数，式中Ab 和Ab′ 分别表示当抗原浓度为Ag和Ag′ 时，产生半数吸光值的抗体浓度（mol/L），n=Ag/ Ag′ 。当n=2时，可得3个KA值，n=4时可得2个KA值，n=8时可得1个KA值，求出6个KA值的均值作为最终结果。KA单位为浓度的倒数，其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。通过实验数据，初步确定5C3株细胞亲和力最高。

4 讨论

本研究以白介素-1受体为免疫原，免疫巴比西小鼠，获得三株抗人白介素-1受体单抗，分别命名为5A5、5C3和1C4。经鉴定，三株单抗亚类均为IgG1，轻链为K链；腹水效价均达到5×10-5以上；酶联免疫吸附实验表明， 三株单抗均能够特异性识别人白介素-1受体。IL-1受体有I型（IL-1R I）和Ⅱ 型（IL-1R II），其中IL-1R I为功能受体，能够启动IL-1信号通路，而IL-1RⅡ 是伪受体，不能启动IL-1下游信号，对IL-1功能起到抑制作用。IL-1RⅠ是IL-1信号通路的关键点，深入研究IL-1R，有助于理解IL-1参与的致病机制，并可能为治疗疾病提供新的靶点[4]。本研究采用人白介素1受体为免疫蛋白，制备抗人白介素1受体单抗并对其生物学特性进行鉴定，为研究IL-1参与的致病机制奠定实验基础。

参考文献：

[1] DINARELLO CA Immunological and inflammatory functions of che interleukin-1 family [J].AnnuRev Immunol， 2009 27（2）：519-550.

[2]萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW（黄培堂，等译）.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002，1474- 1480.

[3]金伯泉.细胞和分子免疫学[M].北京：科学出版社，2001，183-194.

[4] 陈炜烨，庄俊华，黄宪章. 白介素-1受体Ⅰ型研究进展.广东医学 2009年10 月第30卷第10 期