基于Atmega64L的心率监测系统中MCU的设计

刘燕++吴晴晴++刘娟娟

[摘  要]探索基于gyrB靶基因的PCR扩增技术，检测土壤中典型病原菌的最优反应条件和参数。实验目的是建立gyrB基因PCR扩增检测土壤中典型病原菌的最佳反应条件：退火温度、镁离子浓度、引物浓度等。

[关键词]gyrB基因  典型病原菌

中图分类号：TH113.22 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0124-01

引言

研究[1]表明在区别相似种时，gyrB 序列可以比16S rDNA 序列更有优势。在定量分析研究上基于gyrB靶基因的研究方法比基于16S rDNA的方法更适用。本研究建立gyrB基因PCR扩增检测土壤中典型病原菌的最佳反应条件和参数，证明gyrB 基因在土壤中典型病原菌株鉴定上的优势。

1 材料与方法

1.1 土壤样品的采集及预处理

研磨过筛（20目），-80°C保存备用。

1.2 供试病原菌株

鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、福氏志贺菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等。

1.3 主要试剂盒及试剂

FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒（MP Biomedicals， Solon， OH， USA），dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、100 bp DNA Ladder（上海生物工程技术服务有限公司。

1.4 主要仪器

FastPrepTM FP120核酸提取仪（Bio 101， Carlsbad， CA， USA），凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories， Segrate， Italy），S1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories， Segrate， Italy），DYY-2C型电泳仪（北京市六一仪器厂），微量台式离心机IEC Micro CL17（Thermo Fisher，USA）。

1.5 DNA提取

土壤总DNA提取方法：采用FastDNA？ SPIN Kit for Soil试剂盒和FastPrepTM FP120核酸提取仪提取和纯化土壤样品总DNA，具体提取步骤见说明书。

1.6 引物和靶标

合成gyrB基因引物[1]：UP1，GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNG

GNGGNAA

RTTYGA;UP2r，AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTC

NGCRTCNGTCAT，

片段大小1200bp。其中Y指的是C或者T，R 指的是A或者G，N代表任何碱基。

1.7  PCR产物电泳检测

6×上样缓冲液，1%（w/v）琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液，200V恒压电泳，电泳时间25-35min。

2 结果与分析

2.1 扩增条件优化研究

初始反应条件（25μL） 包括10×PCR 缓冲液2.5μL，25mmol/L Mg2+ 2μL，2.5mmol/L dNTP 2.5μL，10μmol/L引物各1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL。

2.2 退火温度

引物UP1和UP2r的Tm值分别为68.1℃、72.37℃，根据PCR 反应退火温度一般应低于Tm值3℃～5℃的原则[2]，实验设计8个温度梯度：73℃、71.2℃、68.4℃、64.3℃、59℃、55.2℃、52.1℃、50℃，研究退火温度对gyrB靶基因PCR扩增的影响。结果见图1：退火温度升高时扩增效率随之下降，条带随之变弱;退火温度越低非特异性片段越多，条带呈现弥散状;最佳退火温度在68.4℃，优于参考文献中的62℃[1]。

2.3 Mg2+浓度

Mg2+ 对PCR扩增反应有显著影响，是Taq DNA聚合酶活性所必需的。浓度过低，酶的活力降低;浓度过高，则催化非特异性扩增[3]。在上述最佳退火温度条件下，加入不同量的Mg2+以研究Mg2+浓度变化对PCR反应的影响。结果见图2：泳道1～6 Mg2+ 的量依次为0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL，结果表明Mg2+量为1.5μL（泳道2）时得到的扩增条带较均一、稳定和清晰。

2.4 引物浓度

本研究初始UP1、UP2r gyrB靶基因引物浓度设为10μmol/L。梯度扩增引物浓度加入量分别设为：0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL。结果见图3：随着引物浓度的增加，扩增效率逐渐提高、目标条带亮度也逐渐增加，但也逐渐出现弥散现象、引物二聚体等;最佳引物的量为上下游引物各0.5μL。

4 小结

优化了gyrB基因PCR扩增检测土壤中典型病原菌的反应体系、反应参数，得出最佳反应体系为：总体系50μL，包括10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTP 5μL，25mmol/L Mg2+ 3μL，10μmol/L引物UP1和UP2r各1μL，NA1μL，5U /μL Taq DNA聚合酶0.5μL，超纯水补足体系。最佳反应参数为95℃，5min（95℃，1min;68.4℃，1min;72℃，2min）35轮循环，72℃，10min。在以上最佳反应参数和条件下获得的核酸质量相对较高。

参考文献

[1]Xia Y， et al. Isolation and characterization of phenanthrene-degrading Sphingomonas paucimobilis strain ZX4. Biodegradation， 2005， 16： 393-402.

[2]Tankouo-Sandjong B， et al. MLST-v， multilocus sequence typing based on virulence genes， for molecular typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars. Journal of Microbiological Methods， 2007， 69：23-36.

[3]萨姆布鲁克， 拉塞尔著， 黄培堂等译. 分子克隆实验指南第三版. 北京科学出版社， 2002：597-611.

作者简介

刘燕，江苏苏州，1986.01， 硕士研究生，研究方向环境微生物、环境检测、环境工程、环境影响评价等