...诊断检测神经元外泌体AD生物标志物的水平.两个分组分别为:(...
李孟娇
[摘 要]外泌体，细胞间物质信息的传递者，在细胞生物学以及分子生物学领域中，扮演着越来越重要的角色。然而目前对于外泌体的分离鉴定还存在一定的困难，因此本文对外泌体的分离鉴定方法进行综述，为外泌体的进一步研究提供更有效的方法。
[关键词]外泌体;分离;鉴定;差速离心法
中图分类号：TU755 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0193-01
近年来，越来越多的证据表明外泌体对于细胞生物学以及医学研究方面具有重要的价值，而由于外泌体的体积结构方面的因素，其分离纯化还存在很大的困难，目前比较常用的分离方法有差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。
1.差速离心法
陈绍倩[1]等人以白血病细胞系K562细胞为材料，采用多步离心的方法成功地提取到了的外泌体。此种实验方法操作不是很复杂，实验设备要求相对简单，拥有超速离心机和细胞培养设备即可，是一种比较简便的提取外泌体的方法，基本可以满足实验研究的要求。但分离纯度不是很高，并且经过多次离心对外泌体的理化性质造成一定的影响。
2.密度梯度离心法
像所有的脂质小囊泡一样， 外泌体悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围从 1.13g/ml到1.210g/ml，将细胞混悬液或匀浆置于蔗糖介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，从而将外泌体从混杂的物质如蛋白聚集物或细胞凋亡的核小体碎片等中分离出来[2]。崔焱[3]等人根据其这一特性，从大量培养的肿瘤细胞上清中分离纯化外泌体，并对此进行了电镜鉴定;在得到大量较高纯度的外泌体的基础上，将其加入含有白细胞介素-2（1L-2）的淋巴细胞培养体系中，观察其对淋巴细胞增殖的影响。
3.超滤离心法
王伟[4]等人以树突状细胞为实验材料，基于对外泌体物理特性，大小以及密度的了解，将超滤离心分离外泌体的方法与传统的分级离心法进行了比较，通过实验证明超滤离心法耗时少，产量和纯度都得到了很大程度的提高，是一种比较高效的制备外泌体的方法。
4.免疫磁珠法
将具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗体，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与磁珠结合而不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。Richard Wubbolts[5]等人在对外泌体进行蛋白质组学和生化分析的过程中，将外泌体的标志性蛋白—抗MHCII抗体包被于磁珠表面，通过抗原抗体特异性识别的特性有效的将外泌体分离出来。
无论采用哪种方法进行分离，如果想对其进行系统的研究都必须首先确定分离得到的产物是不是外泌体，其次要鉴定外泌体是否达到实验所要求的纯度和数量。因此，外泌体的鉴定是必不可少的。目前，常用的鉴定方法主要有电子显微镜观察、动态光散射技术、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术等。
其中电子显微镜观察法是从形态和大小上对外泌体进行鉴定，但由于电镜拍摄视野有限，因此这种方法只能对个别外泌体进行观察。而动态光散射技术则是从整体上对外泌体大小的分布情况进行检测，具有准确、快速、可重复性好等优点，但对于多分散的复杂外泌体样本的测量还存在一定的问题。Western blot则是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体中的标志蛋白进行检测，从蛋白质组学方面对外泌体进行鉴定。
随着科学技术的发展，纳米颗粒跟踪分析技术逐渐成为外泌体鉴定的新技术，不但可以实时对外泌体进行观测，同时还可以对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出外泌体半径和浓度。
外泌体作为细胞间物质信息的传递者，在细胞生物学以及分子生物学领域中，扮演着越来越重要的角色。因此，提高外泌体的分离纯度，改进外泌体的分离方法尤为重要。目前，虽然外泌体的分离与鉴定已经拥有系统的理论基础，但实际操作起来依然存在很多困难，无论是哪种方法，都有各自的优点和缺点，因此只有将各个方法有效的结合起来，例如差速离心法与免疫磁珠法、电镜法与Western blot结合使用，才能达到更好的分离鉴定效果。
参考文献：
[1] 陈绍倩，杜英，王 鑫，顾巧丽，黄玉敏，董子明.多步离心法提取K526细胞外泌体.郑州大学学报（医学版） ，2006，41（3）.
[2] Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol，2002，2：569-579.
[3] 崔焱，于津浦，李慧，杨莉莉，魏枫，安秀梅，任秀宝.肿瘤细胞来源胞外体的分离鉴定与功能检测.天津医药，2009，37（12）.
[4] 王伟，连建奇，王平忠，潘蕾，姬新颖，白雪帆，贾战生.树突状细胞胞外体（Exosome）的超滤离心法提取及形态观察.细胞与分子免疫学杂志，2007，23（12）.
[5] Wubbolts R1，Leckie RS，Veenhuizen PT，Schwarzmann G，M？bius W，Hoernschemeyer J，et al.Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation.J Biol Chem，2003，278（13）：10963-72.
