2016年糖化血红蛋白检测现状及发展趋势分析 目录 .doc

[摘 要]蛋白质的糖基化是生物体内普遍产生的蛋白质翻译后修饰过程，越来越多的研究表明蛋白质糖基化参与人体很多重要的生命活动过程，文章探讨了蛋白质糖基化的作用，糖链的释放、衍生化及定性定量。

[關键词]糖基化；衍生化；定性定量

中图分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）06-0400-01

蛋白质糖基化是指在多肽链合成中，糖链在酶的催化作用下连接到多肽链上的特定氨基酸上的现象。糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，生物体中超过80%的蛋白质发生糖基化。蛋白质糖基化根据其连接的多肽链上氨基酸的不同分为两种：O-糖基化和N-糖基化。N-糖基化是指糖基化位点特定连在Asn-X-Thr/Ser（X是除了Pro之外的氨基酸）这种特定的氨基酸序列上。大多数N-糖链均含有共同的五糖核心结构。O-糖基化通常指寡糖链与多肽链上的Thr/Ser共价相连的结构。

1 蛋白质糖基化的作用

蛋白质的糖基化是在内质网和高尔基体上加工合成的，同时蛋白质上的糖链也才参与许多生物分子的折叠，加工和包装过程。尤其一些糖链是合成有的重要生物分子的合的关键因子。蛋白质的糖基化会影响细胞的免疫功能[1]。几乎所有跟免疫相关的重要因子都是糖蛋白。由于糖链分布在细胞表面，可以有效识别和保护机体。一些神经退行性疾病的发病机制就与糖蛋白上的糖链密切相关，如阿尔兹海默氏症就是一种典型的糖蛋白调控的疾病。

蛋白质糖基化可以控制细胞的增殖分化，尤其是N-糖基化中的复杂型可以有效调节细胞的增殖、分化。糖基化缺陷会引起很多病理过程，N-糖基化缺陷统称为糖基化的先天缺损症，主要为中枢神经系统异常。目前报道的有N-糖链合成缺陷症和N-糖链加工缺陷症。O-糖基化缺陷引起的WWS综合症，表现为眼球结构发育不完全，肌肉萎缩等症。

许多研究表明[3]，一些癌细胞出现的重要标志就是其表面糖链的异常变化，如卵巢癌、肝癌，而这些变化可以增强细胞和细胞之间的粘附和侵袭，从而促进了肿瘤细胞的转移[4]。研究表明肝癌患者的蛋白质没有异常变化的情况下，其糖链上的岩藻糖基化水平显著的不同。甚至，有的糖链只在癌症患者体内表达，因此，把糖链作为疾病标志物就有很高的特异性。如糖链丰度的差异和其分支结构的变化都可能是疾病的前期征兆，可以为癌症的早期诊断和治疗提供重要的信息。

2 糖链的释放

糖链的释放方法通常有两种：酶法和化学法，酶法是利用特异性底物对其特定的结构进行糖链解离的过程，而化学法则是利用肼等化学反应将糖链从糖蛋白上解离下来。其中酶法条件温和，强特异性，能在释放过程中保持糖链的完整性；而化学法则是会在释放糖链过程中破坏糖链的结构，可能会影响后期的研究。

对于N-糖链我们通常采用酶法，常见的有：N-糖肽酶，如PNGase F、PNGase A，内切糖苷酶等。最常用PNGase F酶，他几乎可以断裂除了还原端有α-1，3连接的所有N-糖链，而PNGase A只能释放糖肽上的糖链，且来源局限，价格较贵。内切糖苷酶释放的蛋白上含一个N-乙酰氨基糖胺。由于O-糖链结构缺乏特异性，无高通量的糖苷酶，多采用化学法释放，常用还原性β-消除，肼解法和非还原性β-消除。

还原性β-消除即糖蛋白在碱性条件下释放O-糖链解离，然后在将糖链的醛基还原为醇羟基。其在释放糖链的同时会将其还原端破环，影响后续的色谱和质谱分析。王承健等人发展的释放O-糖链的一锅法[6]，即在碱性条件下，解离O-糖链的同时在糖链上标记两分子PMP，一步反应既达到了释放和标记发色基团的目的，使糖链在释放后就能直接进行色谱分析。简化了步骤且避免了之前的还原性β-消除中的peeling反应。

3 糖链的衍生化

由于糖链自身还有多个羟基，极性较大，很难直接进行气相色谱或者反相高效液相色谱分析，且糖链自身不带发色基团，所以对其进行色谱分析时，要首先对其修饰来降低它的极性或者引入发色基团。常见的衍生化分为两种：还原端和羟基的衍生化。

对糖链羟基的衍生化主要是通过乙酰化或者全甲基化将其羟基封闭，从而降低其极性从而利于后续的色谱分析。对糖链还原端进行衍生化，如Michael加成和还原氨化法。 Michael加成即糖链的醛基在碱性条件下与衍生化试剂发生亲和加成形成复合物。此反应条件温和适合酸性糖的衍生化。

4 糖链的定性定量分析

糖链的结构复杂多样，且随着糖基化的研究越来越深入，发现糖基化与细胞间的识别、粘附、病毒的入侵，甚至癌症的发生发展机制都与有关系密切。对糖链的结构表征是对糖链分析首当其冲要解决的问题。目前对糖链的结构分析主要有色谱、质谱和核磁谱技术。

通常用于糖链的分离色谱有：正相色谱、亲水色谱和凝集素亲和色谱等。由于糖链的多羟基极性较大，所以不能直接用于反相色谱的分离，反相色谱在对糖链进行衍生化之后进行。 Tolstikov等人证明了酰胺色谱柱用于糖链这种极性较强的化合物，且可以和质谱联用定量分析。

目前，质谱技术已经广泛应用到糖链的结构分析中，他能迅速实现对糖链结构和组成的分析，且灵敏度高。质谱技术是让分子或者原子在离子源中电离后，通过加速电场让产生的带电离子进到质量分析器，在磁场和电场下各离子的质荷比差异而产生不同的聚焦和色散，来确定其分子量。质谱对糖链的结构分析，首先是将不同来源的糖链进行富集和纯化，根据后续的分析可以进行衍生化，用质谱对其相对分子量的扫描和MS/MS或MSn分析，从而确定其糖链的序列，对糖链进行同位素标记，根据其丰度还可以达到相对定量的目的。

不同的时期、状态，蛋白质的糖基化程度和糖基化的结构都与特定的病理或者生理过程密切相关[85]。所以对于糖链的定性定量分析对于研究糖链与疾病的关系，某些疾病的发生发展机制和一些疾病的特异性治疗靶标具有重要意义。

参考文献

[1] GagneuxP.， VarkiA.， Evolutionary considerations in relating oligosaccharide diversityto biological function. Glycobiology， 1999， （9）： 747-755 .

[2] Hanson S. R.， Culyba E. K.， Hsu T.-L.， et al. The core trisaccharide of an N-linked glycoprotein intrinsically accelerates folding and enhances stability [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2009， 106（9）： 3131-3136.

[3] Lowe J. B.， Marth J. D. A genetic approach to mammalian glycan function [J]. Annual review of biochemistry， 2003， 72（1）： 643-691.

[4] VanDyke DJ.， Wu J.， Logan S M.， et al. Identification of genes involved in the assembly and attachment of a novel flagellin N‐linked tetrasaccharide important for motility in the archaeon Methanococcus maripaludis [J]. Molecular microbiology， 2009， 72（3）： 633-644.

[5] Sperandio M.， Gleissner CA.， Ley K. Glycosylation in immune cell trafficking. Immune Rev， 2009 （230）：97-113.

[6] Lowe JB. Glycosylation， Immunity， and autoimmunity.Cell， 2001 （104）：809-12.

[7] 金城.糖生物學——破解基因组功能的必由之路。中国科学院研究生院学报，2001（18）：66-75.

作者简介

李晓花（1989-），女，陕西咸阳，助教，硕士，研究方向：药用植物中活性成分的分离纯化，结构和活性分析。