氨基酸分析方法包
程伟 顾大伟
[摘 要]建立氨基酸分析方法，采用反相色谱分离柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相色谱法（HPLC）；阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）；柱前衍生化气相色谱法；衍生化毛细管电泳法测定氨基酸注射液含量。结果 四种方法均可有效检测氨基酸注射液的含量。结论 阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）成熟可靠，稳定性、重现性均优于其它方法。
[关键词]高效液相色谱法（HPLC） 离子交换色谱法（IEC） 柱前衍生化气相色谱法 衍生化毛细管电泳法 氨基酸注射液 含量
中图分类号：G995 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）48-0318-01
前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质，是构成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸影响着生物大分子的活性及其生理功能；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。不同氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系，半胱氨酸能增强生物体的抗病能力，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。目前，对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱（IEC）、高效液相色谱（HPLC）或气相色谱（GC）等仪器，这些仪器所用的检测器通常为紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。然而，由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收较弱，本身又无荧光，所以不能直接检测。通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注，本文对时下流行的氨基酸分析方法优缺点进行评述。
1、IEC方法
为阳离子交换分离，柱后茚三酮衍生光度法测定的一种成熟快速高效的测定方法，使用的衍生试剂为茚三酮，无基体干扰，检测器为可见光，检测限5-10pmol，优点为方法成熟可靠，稳定性、重现性、线性均优于HPLC法，柱子寿命长，几乎可以分析已知的所有氨基酸（最多可同时分离50多种氨基酸），对大多数氨基酸的灵敏度不如HPLC法，仪器专用化，售价较高。IEC仪器使用茚三酮柱后衍生法，符合国家标准和国际仲裁标准，而HPLC法虽然总体性能也比较稳定可靠，但其测量结果与茚三酮法有较大差异，且结果难以长期重复，这对于仲裁不利，目前，HPLC法分析氨基酸一般仅用于不太深入的研究，而且主要是利用其灵敏度较高的特性，也有部分企业用来做内部质量控制，但如果要考虑对外做样并出具结果报告，IEC法是唯一选择。氨基酸种类繁多、性质接近，因此氨基酸分析是色谱界公认的难题，尽管现在有多种多样的方法，但没有任何方法能够保证所有氨基酸峰能够一次进样完全分离。好的HPLC方法最多可以一次分离20种左右的氨基酸峰，IEC法最多一次可分离检测50种左右的氨基酸峰。
2、HPLC法
高效液相反相色谱分离、柱前衍生、光度法测定；对一些氨基酸有很高的灵敏度，使用最流行的反相分离方法，分离条件较易改进，以利于特殊氨基酸的分析，如含磷氨基酸或氨基糖等；分析时间较短，仪器可一机多用，通用性强，可用于分析小肽或其它非氨基酸样品，分析速度快，一般对氨基酸没有破坏；衍生反应和产物稳定性常受基体和过量试剂干扰，方法的稳定性、重现性、线性和可靠性不如茚三酮法，能分离分析的氨基酸种类较少，某些方法不能衍生所有的氨基酸，某些方法对氨基酸产生非单一衍生产物，衍生反应需特定的基质条件，衍生效率取决于本底；对样品制备需要较多的投入，有时过量的试剂会影响分离，某些技术对仪器及操作人员要求较苛刻；且柱子寿命短，衍生试剂一般较贵，方法对操作技术要求高，其中个别方法的稳定性、重现性、线性等指标已接近IEC法，但衍生试剂是独家专利，售价极高，总体成本甚至超过IEC法的仪器。氨基酸分析的成本考量是个重要因素，HPLC做氨基酸分析时，每根柱子只能进样100-500针，而IEC仪器的柱子都能超过1000针，如果使用国产试剂，HPLC仪器单针成本平均160元人民币，IEC仪器单针成本平均不到20元，也就是说当分析样品量超过1000个（进样针数大于2500），IEC专用氨基酸分析仪就开始成为费用最低的仪器了。通常仪器的使用寿命超过8年（平均10年左右），只要每年的样品量大于100个，IEC仪器就没有价格上的劣势。
3、柱前衍生化气相色谱法
气相色谱法分析氨基酸具有柱效高、分离时间短、可以和质谱仪联用等优点。氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极性基团，需要先对其衍生化。衍生化方法分两种：两步法和一步法。两步法为先将羧基用短碳链脂肪醇酯化，然后再用各种酸酐将N-（O，S）基团乙酰化。常用的衍生试剂有正丙醇、异丙醇、三氟乙酰（TFA）、五氟丙酰（PFP）和七氟丁酰（HFB）等一步法是用烃基氯甲酰酯在水、吡啶介质和醇类中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳氧酰烃基酯。此方法的优点是可同时将极性基团衍生化，反应可以在水溶液中进行，反应速度较快，仅需几秒，衍生试剂便宜；缺点是不能与吲哚摹、胍基、羟基和咪唑基完全反应。
4、衍生化毛细管电泳法
毛细管电泳（CE）具有靈敏和柱效高的特点，适用于复杂样品中的氨基酸分析和氨基酸手性分离。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离方式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。检测方式主要有紫外法和荧光法。由于检测池的光路短和体积小，紫外法的应用受到一定的限制。用在衍生化高效液相色谱法中的多数衍生试剂也适用于衍生化毛细管电泳法。在CE中常用的衍生试剂有NDA、OPA、FMOC、Dan2syl-Cl、3-（4-羧基苯甲酰基）-2-喹啉羧基甲醛（CBQCA）、二氢荧光素异硫氰酸酯（FITC）等。此外常用于激光诱导荧光法的衍生试剂有四甲基罗丹明硫代氨基甲酰（TR、9-氰基-N，N，N′-三乙基-N′-（琥珀酰亚胺碳氧酰苯基）焦宁氯（CTSP）、1-甲基碳氧酰吲嗪-3，5-二醛（IDA）、二羰菁琥珀酰亚胺酯（DCC）、3-（对-羧基苯基）喹啉-2-羧醛（CBQ）等。衍生化毛细管电泳法除了可以进行柱前衍生化外，还可以进行柱后和柱内衍生化。柱内衍生化要求反应速度快，一般采用串联或“夹心饼”两种形式进行，具有样品用量和试剂少的优点。
综上所述，IEC法为阳离子交换色谱分离—柱后茚三酮衍生化方法，作为经典的氨基酸分析方法，以其可靠性和可自动化经历了时间的考验。符合国标及国际仲裁标准，衍生时间，衍生温度等无样品间差异，稳定性、分辨率、分离度俱佳，色谱柱寿命更长，单样成本低，成熟可靠，稳定性、重现性均优于其它方法。
参考文献
[1] 曾念辉，氨基酸的分析方法综述，江西化工，2007年第一期.
[2] 常碧影，氨基酸分析技术的发展与应用，中国农业科学院分析测试中心.
